Métodos de engenharia genética para obtenção de proteínas recombinantes. Mutagênese localizada e engenharia de proteínas Investigação das propriedades biológicas do sensor fluorescente Vhh41-KTNFin vitro e in vivo

Depois de considerar como gerar mutações específicas do local, é apenas um passo a dar para enfrentar o ramo em expansão da genética molecular chamado engenharia de proteínas. De facto, o desenvolvimento de métodos de mutagénese dirigida tornou possível não só modificar proteínas individuais com elevada precisão e estudar as suas relações estruturais e funcionais, mas também construir novas proteínas que não existiam na natureza. Resultados impressionantes desta abordagem são proteínas híbridas obtidas pela combinação de fragmentos e domínios funcionais de diferentes cadeias polipeptídicas utilizando métodos de engenharia genética.

Outra área promissora da engenharia de proteínas é o desenho de peptídeos biologicamente ativos com atividade farmacológica.

Bibliotecas de peptídeos e epítopos

Em um organismo vivo, a maioria dos processos biológicos é controlada por interações específicas proteína-proteína ou proteína-ácido nucleico. Tais processos incluem, por exemplo, a regulação da transcrição genética sob a influência de vários fatores proteicos, a interação de ligantes proteicos com receptores na superfície celular e a ligação específica de antígenos pelos anticorpos correspondentes. Compreender os mecanismos moleculares da interação de ligantes proteicos com receptores é de grande importância fundamental e aplicada. Em particular, o desenvolvimento de novos medicação a natureza proteica geralmente começa com a identificação da sequência original de aminoácidos com a atividade biológica desejada (a chamada sequência "básica" (principal)). No entanto, peptídeos com sequência básica de aminoácidos também podem apresentar propriedades biológicas indesejáveis: baixa atividade, toxicidade, baixa estabilidade no organismo, etc.

Antes do advento das bibliotecas de peptídeos, a melhoria de suas propriedades biológicas era realizada por meio da síntese sequencial de um grande número de análogos e do teste de sua atividade biológica, o que exigia muito tempo e dinheiro. Nos últimos anos, tornou-se possível criar milhares de peptídeos diferentes em um curto espaço de tempo utilizando sintetizadores automáticos. Os métodos desenvolvidos de mutagénese dirigida também tornaram possível expandir dramaticamente o número de proteínas obtidas simultânea e sequencialmente testadas quanto à actividade biológica. No entanto, apenas recentemente abordagens desenvolvidas para a criação de bibliotecas de péptidos levaram à produção de milhões de sequências de aminoácidos necessárias para um rastreio eficaz, a fim de identificar entre elas os péptidos que melhor satisfazem os critérios. Tais bibliotecas são utilizadas para estudar a interação de anticorpos com antígenos, para desenvolver novos inibidores enzimáticos e agentes antimicrobianos, para projetar moléculas com a atividade biológica desejada ou para conferir novas propriedades a proteínas, como anticorpos.

As bibliotecas de peptídeos são divididas em três grupos de acordo com os métodos de obtenção. O primeiro grupo inclui bibliotecas obtidas por síntese química de peptídeos, nas quais peptídeos individuais são imobilizados em microtransportadores. Com esta abordagem, após a adição dos próximos aminoácidos em misturas de reação individuais aos peptídeos imobilizados em microtransportadores, os conteúdos de todas as misturas de reação são combinados e divididos em novas porções, que são utilizadas na próxima etapa de adição de novos resíduos de aminoácidos. Após uma série dessas etapas, os peptídeos são sintetizados contendo as sequências de aminoácidos utilizadas na síntese em todos os tipos de combinações aleatórias.

Bibliotecas de peptídeos imobilizados em microtransportadores apresentam uma desvantagem significativa: requerem o uso de receptores purificados na forma solúvel para triagem. Ao mesmo tempo, na maioria dos casos, em testes biológicos realizados para pesquisas fundamentais e farmacológicas, os receptores associados à membrana são os mais utilizados. De acordo com o segundo método, as bibliotecas de peptídeos são obtidas utilizando síntese de peptídeos em fase sólida, na qual misturas equimolares de todos ou alguns aminoácidos precursores são utilizadas em cada estágio da adição química do próximo aminoácido às cadeias peptídicas em crescimento. Na fase final da síntese, os péptidos são separados do transportador, i. convertendo-os em uma forma solúvel. A terceira abordagem para a construção de bibliotecas de peptídeos, que descreveremos agora, tornou-se real precisamente devido ao desenvolvimento de métodos de engenharia genética. Ilustra perfeitamente as possibilidades de tais métodos e é, sem dúvida, uma grande conquista na sua aplicação. A este respeito, consideremos mais detalhadamente os resultados da utilização de bibliotecas de peptídeos no estudo. epítopos(determinantes antigênicos) proteínas.

A tecnologia da engenharia genética para obtenção de proteínas híbridas permitiu desenvolver um método eficaz de produção de peptídeos curtos para análise de sua atividade biológica. Tal como no caso das bibliotecas de genes, as bibliotecas de péptidos geneticamente modificados representam um grande conjunto (muitas vezes exaustivo) de péptidos curtos. Duas observações recentes tornam possível considerar uma biblioteca de peptídeos ao mesmo tempo que uma biblioteca de epítopos proteicos. Primeiro, os peptídeos curtos podem incluir todos os principais resíduos de aminoácidos que desempenham um papel importante na interação com os anticorpos e são capazes de imitar os grandes determinantes antigênicos das proteínas. Em segundo lugar, na maioria dos casos, as ligações não covalentes formadas entre os poucos resíduos de aminoácidos mais importantes dos ligantes proteicos e seus receptores constituem a principal contribuição para a energia total da interação ligante-receptor. Com isto em mente, qualquer peptídeo pode ser considerado como um ligante potencial, hapteno ou parte do determinante antigênico de polipeptídeos maiores, e qualquer biblioteca de peptídeos pode ser considerada como uma biblioteca de epítopos proteicos ou ligantes potenciais para os receptores proteicos correspondentes.

Arroz. II.19. Esquema de expressão de epítopos peptídicos na superfície da casca de colífagos filamentosos

Os epítopos peptídicos fazem parte das cadeias polipeptídicas híbridas da proteína menor pIII ( A) ou a proteína central pVIII do envelope viral ( b). As setas indicam a posição dos fragmentos de oligonucleótidos que codificam o epítopo no genoma do bacteriófago, bem como a posição dos próprios epítopos. Como parte do polipeptídeo pIII ( A) mostra apenas uma cópia do epítopo (na verdade, seu número chega a 4-5)

A biblioteca de peptídeos obtida como resultado da implementação da terceira abordagem, em sua forma moderna, é um conjunto de dezenas ou mesmo centenas de milhões de sequências curtas de aminoácidos diferentes que são expressas na superfície de vírions de bacteriófagos como parte de seus próprios. proteínas estruturais. Isto se torna possível devido à introdução de genes recombinantes híbridos que codificam proteínas estruturais alteradas de seus vírions no genoma do bacteriófago por engenharia genética. (Este método é conhecido como exibição de fago.) Como resultado da expressão de tais genes, são formadas proteínas híbridas, nos terminais N ou C das quais (ver abaixo) existem sequências de aminoácidos adicionais. O sistema mais bem desenvolvido, que permite construir bibliotecas de peptídeos por métodos de engenharia genética, utiliza um pequeno colifago filamentoso f1 e duas de suas proteínas: as proteínas de envelope maior e menor pVIII e pIII. In vivo, ambas as proteínas são sintetizadas como cadeias polipeptídicas com sequências sinalizadoras N-terminais curtas que são clivadas por uma peptidase sinalizadora durante sua maturação após serem transferidas para o interior da membrana bacteriana. Proteínas maduras são incorporadas ao envelope do bacteriófago durante sua montagem. Nesse caso, a proteína pVIII forma a concha principal do bacteriófago, enquanto quatro ou cinco moléculas pIII estão associadas à parte terminal do vírion e garantem a interação das partículas virais com as vilosidades genitais das células de E. coli (Fig. II .19). Por métodos de engenharia genética, os peptídeos são conectados a proteínas - diretamente às suas sequências N-terminais ou a uma curta distância delas. As sequências terminais da maioria das proteínas são mais flexíveis e, via de regra, ficam expostas na superfície do glóbulo, o que permite a obtenção de proteínas recombinantes híbridas sem violação significativa de suas propriedades básicas, e também torna os peptídeos integráveis acessíveis para reconhecimento de o lado de fora. Além disso, nesta posição, a estrutura espacial dos próprios péptidos é menos influenciada pela proteína transportadora. Durante os experimentos, descobriu-se que a introdução de peptídeos estranhos na parte N-terminal da proteína pIII não afeta significativamente a viabilidade e infectividade das partículas fágicas, enquanto a combinação de peptídeos com mais de 5 resíduos de aminoácidos de comprimento com o N- a parte terminal da proteína pVIII interrompe a montagem dos vírions. A última dificuldade pode ser ultrapassada através da entrega de moléculas de proteína pVIII de tipo selvagem ao local de montagem do virião, cuja síntese é dirigida pelo gene correspondente do vírus auxiliar. Neste caso, o envelope do bacteriófago conterá proteínas pVIII alteradas e polipéptidos de tipo selvagem do vírus auxiliar.

Arroz. II.20. Esquema para construção de um genoma viral recombinante contendo inserções de oligonucleotídeos degenerados para obter uma biblioteca de epítopos

Oligonucleotídeo de fita dupla ( A) contendo códons NNK degenerados e os mesmos locais de restrição nos ligantes são ligados ao DNA do vetor Fuse5 ( b) clivado por enzima de restrição ficção científica I, com a formação de um genoma recombinante ( V), que direciona a síntese de uma proteína recombinante híbrida ( G) contendo a sequência de aminoácidos especificada no terminal N

Ao construir uma biblioteca de peptídeos, em primeiro lugar, são sintetizados dois oligonucleotídeos complementares que, após o recozimento, formam uma molécula de fita dupla, cuja parte central codifica os próprios peptídeos (Fig. II.20, A), e as regiões de fita simples salientes nas extremidades são complementares às extremidades "pegajosas" do vetor, resultantes da ação da enzima de restrição correspondente (ver Fig. II.20, b).

Para codificar os aminoácidos dos peptídeos, são utilizados códons degenerados do tipo NNK ou NNS, que incluem todos os quatro nucleotídeos (N) na primeira e segunda posições, G ou T (K), e G ou C (S) na terceira posição. Com esta abordagem, as informações sobre todos os 20 aminoácidos e um códon de parada estão contidas em 32 códons NNK e NNS diferentes, e não em 64, como é o caso do código genético natural.

Durante a síntese de oligonucleotídeos degenerados que codificam os peptídeos estudados, são utilizados nucleotídeos individuais em cada etapa para os códons de aminoácidos invariantes que flanqueiam a região variável do peptídeo, bem como misturas equimolares de nucleotídeos para regiões que codificam sequências aleatórias. O conjunto resultante de oligonucleótidos degenerados é então clonado como fragmentos de cadeia simples nos locais apropriados do gene da proteína do envelope do bacteriófago dentro do vector fago ou fasmídeo. Alternativamente, para tal conjunto de oligonucleotídeos (quimicamente ou por PCR), são sintetizadas fitas complementares com inosina incluída nas regiões variáveis, uma vez que se sabe que seus resíduos emparelham com as bases C e T do molde, o que facilita a formação de duplexes corretos entre os oligonucleotídeos correspondentes. Os oligonucleótidos de cadeia dupla resultantes, se necessário, são tratados com enzimas de restrição apropriadas e clonados num vector fago. As moléculas recombinantes finais (ver Fig. II.20, V) O DNA é introduzido em células bacterianas, obtendo-se ~10 9 transformantes por 1 mg de DNA recombinante, as partículas fágicas resultantes são propagadas em bactérias e, após purificação, examinadas quanto à presença de peptídeos recombinantes (ver Fig. II.20, G) capaz de interagir com os receptores estudados nas proteínas de seus vírions.

O número de clones de fagos individuais numa biblioteca é crítico para a sua utilização. Por exemplo, uma biblioteca contendo todos os hexapeptídeos possíveis deve conter 64 milhões (20 6) diferentes sequências de aminoácidos de seis membros codificadas por ~1 bilhão (32 6) hexacódons diferentes (32 é o número de códons que podem codificar qualquer um dos 20 aminoácidos ácidos pelo método proposto acima, nomeadamente utilizando os codões NNK ou NNS). Para resolver tal problema, muito grandes bibliotecas, contendo pelo menos 2·10 8 - 3·10 8 clones individuais independentes, e o valor de 10 9 é atualmente o limite superior para o número de clones individuais da biblioteca, que ainda pode ser utilizado na prática.

Com base nisso, pode-se concluir que o comprimento máximo dos peptídeos, incluindo todas as combinações possíveis de 20 aminoácidos que podem ser trabalhadas utilizando bibliotecas de peptídeos, é de 6 resíduos de aminoácidos. Contudo, deve ter-se em mente que uma biblioteca de péptidos 15-meros do mesmo tamanho (2-3x108 clones) conterá hexapéptidos mais diversos do que a biblioteca de péptidos 6-mero discutida acima. Além disso, uma vez que apenas um número limitado de resíduos de aminoácidos num péptido determina realmente a sua actividade biológica, uma biblioteca de péptidos 15-meros pode ser mais representativa do que uma biblioteca de péptidos mais curtos com o mesmo número de clones.

Arroz. II.21. Esquema para a seleção de partículas fágicas com os epítopos necessários

São mostradas três partículas fágicas recombinantes que expressam diferentes epítopos dentro de pIII. Apenas o epítopo da partícula central do fago é reconhecido pela molécula de anticorpo biotinilado imobilizada em uma placa de Petri com estreptavidina e usada para rastrear a biblioteca

De modo a isolar péptidos com a actividade biológica desejada da biblioteca, são utilizados vários métodos de rastreio. Em particular, para isolar péptidos que mimetizam certos epítopos, utilizam-se anticorpos monoclonais biotinilados de especificidade apropriada, que são imobilizados num suporte sólido utilizando estreptavidina (Fig. II.21). As partículas fágicas que expressam os epítopos apropriados na sua superfície interagem com os anticorpos e são retidas pelo suporte, enquanto outras partículas fágicas recombinantes são removidas durante o processo de lavagem. As partículas fágicas retidas no substrato são ainda eluídas com ácido, os clones individuais são adicionalmente propagados em células bacterianas e os epítopos neles expressos são examinados de acordo com vários critérios. A presença de sequências de nucleotídeos idênticas ou semelhantes entre as sequências clonadas indica a especificidade do processo de purificação. Os clones individuais são então caracterizados por outros métodos, em particular métodos de imunoensaio enzimático. Na fase final do estudo, é realizada a síntese dos peptídeos isolados e seu estudo abrangente no estado purificado.

Atualmente, existem dados de alguns trabalhos realizados com utilização de bibliotecas de peptídeos. Num destes estudos, foram isolados péptidos da biblioteca, cuja sequência de aminoácidos diferia acentuadamente da sequência de aminoácidos do epítopo verdadeiro do antigénio em estudo. Contudo, um tal péptido liga-se fortemente a anticorpos específicos e compete pela ligação ao antigénio natural. Isto levou à conclusão de que a existência de mimotopos– peptídeos curtos que imitam epítopos naturais, cujas sequências de aminoácidos diferem significativamente umas das outras. Foi possível estabelecer as sequências canônicas de aminoácidos de peptídeos que imitam os epítopos das proteínas naturais, e entre elas identificar resíduos de aminoácidos que desempenham um papel fundamental na interação antígeno-anticorpo.

Uma das aplicações promissoras das bibliotecas de peptídeos é a identificação de ligantes peptídicos que imitam epítopos "estruturais" formados na superfície de glóbulos de proteínas como resultado do dobramento de suas cadeias polipeptídicas, que é acompanhado pela convergência espacial de resíduos de aminoácidos localizados em um distâncias consideráveis entre si na cadeia polipeptídica. Utilizando bibliotecas peptídicas, é possível identificar análogos peptídicos de vários epítopos não proteicos. Aparentemente, num futuro próximo, será possível utilizar bibliotecas de peptídeos para obter novos medicamentos, criar ferramentas de diagnóstico e produzir vacinas eficazes. No campo do desenho de novos medicamentos, os esforços dos pesquisadores poderiam ser direcionados para a criação de ligantes peptídicos que interajam especificamente com receptores de interesse biomédico. O conhecimento da estrutura de tais ligantes permitiria simplificar a preparação de medicamentos não proteicos nesta base.

Bibliotecas de peptídeos e epítopos também encontrarão sua aplicação em estudos dos mecanismos da resposta imune humoral, bem como de doenças. sistema imunológico. Em particular, a maioria das doenças autoimunes é acompanhada pela formação de autoanticorpos contra os antígenos do próprio corpo. Em muitos casos, esses anticorpos servem como marcadores específicos para uma doença autoimune específica. Utilizando uma biblioteca de epítopos, em princípio, é possível obter marcadores peptídicos com os quais seria possível monitorar a especificidade dos autoanticorpos durante o desenvolvimento de um processo patológico, como em organismo individual, e em um grupo de pacientes e, além disso, determinar a especificidade dos autoanticorpos em doenças de etiologia desconhecida.

Bibliotecas de peptídeos e epítopos também podem potencialmente ser usadas para triagem de soros imunes, a fim de identificar peptídeos que interajam especificamente com anticorpos protetores. Tais péptidos imitarão os determinantes antigénicos de organismos patogénicos e servirão como alvos para os anticorpos protectores do corpo. Isto permitirá a utilização de tais péptidos para a vacinação de pacientes que não possuem anticorpos contra os respectivos patógenos. O estudo de epítopos utilizando bibliotecas peptídicas é um caso especial de uma das inúmeras áreas de sua utilização em estudos aplicados e fundamentais da interação de ligantes e receptores. Melhorias adicionais nesta abordagem deverão contribuir para a criação de novos medicamentos baseados em peptídeos curtos e ser úteis em estudos fundamentais dos mecanismos de interações proteína-proteína.

A proteína em termos químicos é uma molécula do mesmo tipo, que é uma cadeia ou polímero de poliaminoácidos. É composto por sequências de aminoácidos de 20 tipos. Conhecendo a estrutura das proteínas, as pessoas se perguntavam: é possível projetar sequências de aminoácidos completamente novas para que funcionem necessário para uma pessoa funciona muito melhor do que proteínas normais? Para essa ideia ousada, o nome é mais adequado engenharia de proteínas.

Eles começaram a pensar nessa engenharia na década de 50 do século XX. Isso aconteceu imediatamente após a decodificação das primeiras sequências de aminoácidos da proteína. Em muitos laboratórios ao redor do mundo, foram feitas tentativas de duplicar a natureza e sintetizar quimicamente sequências de poliaminoácidos dadas de forma absolutamente arbitrária.

Acima de tudo, o químico B. Merrifield conseguiu isso. Este americano conseguiu desenvolver uma personalidade extremamente método eficaz síntese de cadeias de poliaminoácidos. Para isso, Merrifield foi premiado em 1984 premio Nobel em química.

O americano começou a sintetizar peptídeos curtos, inclusive hormônios. Ao mesmo tempo, construiu um autômato – um “robô químico” – cuja tarefa era produzir proteínas artificiais. O robô causou sensação no meio científico. Porém, logo ficou claro que seus produtos não poderiam competir com o que a natureza produz.

O robô não conseguiu reproduzir exatamente as sequências de aminoácidos, ou seja, errou. Ele sintetizou uma cadeia com uma sequência e a outra com uma sequência ligeiramente diferente. Numa célula, todas as moléculas de uma proteína são idealmente semelhantes entre si, ou seja, suas sequências são exatamente iguais.

Houve também outro problema. Mesmo aquelas moléculas que o robô sintetizou corretamente não assumiram a forma espacial necessária ao funcionamento da enzima. Assim, a tentativa de substituir a natureza pelos métodos usuais de química orgânica levou a um sucesso muito modesto.

Se selecionarmos mutantes com as propriedades necessárias, digamos, processando com mais eficiência este ou aquele substrato, então poderemos isolar desse mutante uma enzima alterada, devido à qual a célula adquire novas propriedades. Mas esse processo leva muito tempo.

Tudo mudou quando a engenharia genética apareceu. Graças a ela, começaram a criar genes artificiais com qualquer sequência de nucleotídeos. Estes genes foram inseridos em moléculas de vector preparadas e estes ADN foram introduzidos em bactérias ou leveduras. Lá, uma cópia do RNA foi retirada do gene artificial. Como resultado, a proteína desejada foi produzida. Foram excluídos erros na sua síntese. O principal era escolher a sequência correta de DNA e então o próprio sistema enzimático da célula fazia seu trabalho perfeitamente.

Assim, podemos concluir que a engenharia genética abriu caminho para a engenharia de proteínas na sua forma mais radical. Por exemplo, escolhemos uma proteína e queríamos substituir um resíduo de aminoácido por outro.

Antes de iniciar os trabalhos de substituição, é necessário preparar um vetor de DNA. Este é o DNA viral ou plasmidial com o genoma da proteína que nos interessa incorporado nele. Você também precisa conhecer a sequência de nucleotídeos do gene e a sequência de aminoácidos da proteína codificada. Este último é determinado a partir do primeiro usando a tabela do código genético.

Com a ajuda da tabela também é fácil estabelecer quais alterações mínimas devem ser feitas na composição do gene para que ele comece a codificar não o original, mas a proteína alterada a nosso pedido. Digamos que no meio do gene você precise substituir a guanina pela timina.

Por causa de uma bagatela tão pequena, não é necessário ressintetizar todo o gene. Apenas um pequeno fragmento de nucleotídeos é sintetizado, complementar ao sítio, no meio do qual está localizado o nucleotídeo guanina selecionado para substituição.

O fragmento resultante é misturado com um vetor de DNA (DNA circular), que contém o gene que precisamos. O anel de DNA e o fragmento sintetizado criam uma porção da dupla hélice de Watson-Crick. Nele, o par central é “empurrado para fora” da dupla hélice, pois é formado por nucleotídeos mutuamente não complementares.

Adicione quatro dNTPs e DNA polimerase à solução. Este último, utilizando um fragmento aderido a um único anel, completa-o num anel completo em plena conformidade com o princípio da complementaridade.

O resultado é um DNA vetorial quase normal. Pode ser injetado em uma levedura ou célula bacteriana para reprodução. A única coisa é que esse DNA difere do vetor original por um par não complementar. Em outras palavras, a hélice do vetor de DNA não é completamente perfeita.

Logo no primeiro ato de duplicação do vetor resultante, junto com a bactéria que o transporta, cada uma das moléculas filhas de DNA se tornará uma dupla hélice perfeita ao longo de todo o seu comprimento. Porém, uma das moléculas filhas carrega o par de nucleotídeos original, e a outra possui um vetor mutante neste local, com base no qual é obtida a proteína mutante que nos interessa.

Assim, a engenharia de proteínas cria uma mistura de células. Algumas delas carregam o vetor original com o gene do tipo selvagem, enquanto outras células carregam o gene mutado. Resta selecionar desta mistura precisamente aquelas células nas quais o gene mutante está localizado.

Os métodos de engenharia genética, em particular a clonagem de genes individuais ou de suas partes, bem como o sequenciamento de DNA, permitiram melhorar significativamente a metodologia de mutagênese, eliminando as principais desvantagens dos métodos clássicos de indução de mutações nos genomas. Clássico análise genética sugere o efeito de um fator mutagênico in vivo em todo o genoma, resultando em mutações aleatórias, muitas vezes múltiplas, o que complica muito a identificação de mutantes. A identificação dos mutantes é realizada por características fenotípicas alteradas, e a natureza da mutação pode ser determinada após sequenciamento do DNA. A mutagênese localizada moderna, de fato, envolve ações inversas: primeiro, o gene ou seu segmento de interesse é clonado, sua estrutura é determinada durante o sequenciamento e, em seguida, as alterações necessárias são feitas in vitro em sua composição. As consequências da mutação induzida são determinadas após a introdução do gene mutante no organismo original.

A variante mais simples da mutagênese localizada consiste no tratamento de um fragmento de DNA clonado com um dos fatores mutagênicos, porém, tal exposição também resultará em alterações aleatórias na estrutura do fragmento. Métodos de mutagênese localizada mais confiáveis e mais comumente usados são realizados sem o uso de fatores mutagênicos. Entre os tipos de mutações predominam deleções, inserções e substituições de nucleotídeos.

Exclusões. Esses tipos de mutações são produzidos por endonucleases por mutagênese localizada. São utilizadas endonucleases restritivas e não específicas. O uso mais simples das enzimas de restrição é clivar um genoma com uma enzima de restrição que introduz várias quebras com a formação de extremidades adesivas. Os fragmentos resultantes são novamente fechados em anel com DNA ligase, o que pode levar à formação de moléculas que não contêm um dos segmentos de DNA. Esta abordagem produz grandes deleções e é geralmente utilizada em experiências preliminares para determinar as funções de secções relativamente grandes de ADN clonado.

Pequenas deleções são obtidas como segue. O fragmento clonado é digerido no vetor no local apropriado com uma enzima de restrição (Fig. 21.1). A molécula linear resultante é tratada com exonuclease III, que hidrolisa uma fita do DNA,

começando no final de 3'. O resultado é um conjunto de moléculas com caudas 5' de fita simples de diferentes comprimentos. Essas caudas são hidrolisadas pela nuclease S1 específica de DNA de fita simples e deleções são formadas no DNA. Também é possível utilizar a exonuclease Bal 31, que catalisa a degradação de ambas as fitas, a partir das extremidades das moléculas lineares de DNA. O curso das reações nucleóticas é regulado pela variação do tempo de incubação, da temperatura e da concentração da enzima, induzindo a formação de deleções. comprimentos diferentes. As variantes de deleção linear de DNA resultantes são frequentemente fornecidas com ligantes antes da ciclização, de modo que os sítios de restrição estejam presentes na região da deleção. Existem outras modificações dos métodos descritos.

Inserções (inserções). Para obter inserções, o DNA clonado é digerido com uma enzima de restrição ou uma endonuclease não específica e, em seguida, os fragmentos resultantes são ligados na presença do segmento a ser inserido no DNA. Na maioria das vezes, poliligantes sintetizados quimicamente são usados como tais segmentos (Capítulo 20).

As inserções, assim como as deleções, podem perturbar a integridade do gene ou a estrutura de suas regiões reguladoras, resultando na síntese de uma proteína defeituosa (no caso de deleções estendidas ou frameshift, geralmente inativas) ou alterações no processo de transcrição do gene de interesse. Mutantes reguladores são frequentemente obtidos desta forma e vetores expressos são construídos (Capítulo 20).

Mutações pontuais . Essas mutações são substituições de nucleotídeos. Várias abordagens podem ser utilizadas para obtê-los: desaminação de citosina, inclusão de análogos de nucleotídeos, inclusão incorreta de nucleotídeos durante reparo de gap, etc.

O primeiro método baseia-se no fato de que os resíduos de citosina no DNA de fita simples podem ser desaminados para formar uracila por tratamento com íons bissulfito. As regiões de fita simples no DNA são geralmente obtidas próximas a locais de restrição, por exemplo, pela ação da exonuclease III. Após o tratamento com bissulfito, as lacunas da fita simples são preenchidas com DNA polimerase e as extremidades são ligadas. Nos locais onde o uridilato foi formado em vez do citidilato durante a desaminação, o adenilato assumirá a posição complementar e, durante a replicação de tal molécula, o par GC será substituído pelo par AT.

Outra abordagem para a indução de substituições é tratar o DNA clonado com alguma enzima de restrição na presença de brometo de etídio, que se insere entre os planos dos pares de bases e introduz distúrbios na estrutura duplex. Como resultado, apenas uma quebra de fita simples de DNA é formada. Uma pequena lacuna é criada no local da quebra da fita simples e então construída na presença de DNA polimerase, dATP, dGTP, dCTP e trifosfato de N-4-hidroxicitosina em vez de dTTP. O trifosfato de hidroxicitosina é incluído na cadeia em vez do timidilato, mas durante a replicação do DNA ele combina igualmente bem com o adenilato e o guanilato. Como resultado da incorporação do guanilato, após uma rodada adicional de replicação, a substituição AT → GC ocorrerá neste sítio (Fig. 21.2). Porque em este método a substituição de nucleotídeos é realizada dentro

local de restrição, torna-se possível distinguir facilmente entre vetores com a sequência original e aqueles mutados. Para isso, basta tratá-las com a enzima de restrição utilizada no experimento: as moléculas mutantes não sofrerão clivagem.

Um método semelhante é baseado no uso de apenas três dos quatro nucleotídeos possíveis ao preencher uma lacuna de fita simples com DNA polimerase. Na maioria dos casos, a enzima para no local da molécula onde encontra um nucleotídeo complementar ao que falta. No entanto, ocasionalmente a DNA polimerase erra e inclui um dos três nucleotídeos presentes. Isso leva à formação de moléculas em anel, que contêm bases nitrogenadas não complementares desemparelhados. Quando esses vetores são introduzidos nas células bacterianas, algumas das moléculas repararão esses danos. Como resultado, a sequência original será restaurada em metade das moléculas após a replicação e a mutação será fixada na outra metade. As moléculas mutantes podem ser distinguidas pelo método descrito acima.

Mutagênese específica do local. Os métodos de mutagénese localizada caracterizados são caracterizados por os locais onde ocorrem as mutações serem escolhidos aleatoriamente. Ao mesmo tempo, a técnica de mutagénese sítio-específica permite introduzir mutações numa região precisamente definida de um gene. Isto é realizado utilizando oligonucleotídeos sintéticos (obtidos por síntese química) com uma determinada sequência. O método é conveniente porque não requer a presença de locais de restrição convenientes. O método baseia-se na formação de heteroduplexes entre um oligonucleotídeo sintético contendo uma mutação e DNA de fita simples complementar no vetor.

Proceda da seguinte forma. É sintetizado um pequeno oligonucleotídeo (8-20 monômeros) que é complementar à parte do gene na qual se deseja obter uma mutação. Na composição do oligonucleotídeo na região central são permitidas uma ou mais substituições de nucleotídeos. O gene investigado ou seu fragmento é clonado no vetor baseado no fago M13 para obter DNA recombinante circular de fita simples. Produza mistura e recozimento de vetores recombinantes com oligonucleotídeos. O oligonucleotídeo hibridiza com a região complementar, enquanto os nucleotídeos não complementares permanecem desemparelhados. O oligonucleotídeo atua como um iniciador na reação da polimerase envolvendo a DNA polimerase in vitro. O anel é fechado com ligases. A molécula circular resultante é introduzida em células de E. coli, onde ocorre reparo parcial de locais de replicação mutantes. A taxa de mutação geralmente varia de 1 a 50%. A seleção de células contendo moléculas de DNA mutantes pode ser feita de diversas maneiras, dentre as quais tem a vantagem o método que utiliza um oligonucleotídeo radiomarcado, que é utilizado para mutagênese. EM este caso este nucleotídeo serve como uma sonda. O princípio de utilização de tal sonda baseia-se no facto de ser totalmente complementar ao ADN mutante e parcialmente complementar ao ADN de tipo selvagem. É possível escolher tais condições de hibridização (em primeiro lugar, temperatura) que a hibridização da sonda marcada será estável apenas com a sequência de DNA mutante, que pode ser detectada por radioautógrafo.

O método de mutagénese específica do local é especialmente valioso porque permite isolar mutações sem controlar a sua manifestação fenotípica. Este método abre novas possibilidades para estudar as funções dos elementos reguladores dos genes, permite alterar a "força" dos promotores, otimizar os sítios de ligação com os ribossomos, etc. engenharia de proteínas.

Engenharia de proteínas. Esta frase denota um conjunto de técnicas metodológicas que permitem a reconstrução de uma molécula de proteína através da introdução direcionada de mutações apropriadas num gene estrutural (mutagénese sítio-específica) e, consequentemente, as substituições de aminoácidos desejadas na estrutura primária da proteína.

Um exemplo ilustrativo da construção de proteínas mais ativas são os experimentos de Fersht e colaboradores com a enzima tirosil-tRNA sintetase da bactéria Bacillus stearothermophilus. Uma análise das consequências das substituições de aminoácidos no sítio ativo desta enzima levou à conclusão de que a remoção de grupos que formam ligações de hidrogênio fracas com o substrato pode melhorar sua afinidade pelo substrato. Verificou-se que a treonina-51 (ocupa a 51ª posição no peptídeo) forma uma ligação de hidrogênio longa e fraca com o oxigênio do anel ribose quando o adenilato de tirosil está ligado. Ao mesmo tempo, verificou-se que a prolina ocupa a mesma posição na bactéria E. coli. A mutagênese sítio-específica do gene que determina a estrutura da tirosil-tRNA sintetase de B.stearothermophilus tornou possível fornecer uma substituição thr-51→pro-51 em um peptídeo. Como resultado, a ligação do ATP no centro ativo da enzima melhorou dramaticamente e a sua atividade catalítica aumentou 25 vezes.

Outro exemplo igualmente significativo de reconstrução proteica de importância prática é a modificação da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, realizada por Estelle et al. Subtilisinas são serina proteinases secretadas por bacilos no meio ambiente. Essas enzimas são produzidas em larga escala pela indústria de biotecnologia e são amplamente utilizadas em formulações de detergentes. A desvantagem das subtilisinas é uma diminuição acentuada da atividade proteolítica sob a ação de agentes oxidantes, incluindo aqueles contidos em detergentes em pó. A tarefa de reconstruir a molécula de subtilisina BPN era estabilizá-la contra a oxidação química.

Em experimentos preliminares, verificou-se que na presença de peróxido de hidrogênio, a subtilisina reduz rapidamente a atividade devido à oxidação do resíduo metionina-222, que se transforma no sulfóxido correspondente. Métodos de mutagénese específica do local garantiram a substituição deste resíduo de metionina por todos os outros 19 aminoácidos proteicos. Plasmídeos com genes mutantes foram introduzidos em cepas com deleções nos genes correspondentes e as propriedades das subtilisinas produzidas foram analisadas. Mutantes com serina e alanina mostraram-se suficientemente estáveis à ação do peróxido222. O mutante contendo o resíduo cisteína-222 revelou-se o mais ativo; sua atividade específica excedeu a da cepa do tipo selvagem em 38%.

De forma semelhante, foi possível aumentar a atividade do interferon b. Entre outras conquistas da engenharia de proteínas, podem-se citar estudos para elucidar a atividade transformadora de oncoproteínas; alteração da termoestabilidade de enzimas, por exemplo, obtenção de renina termolábil e a-amilase termoestável; um aumento na eficiência de ligação da insulina pelo receptor de membrana plasmática correspondente devido à substituição da histidina por aspartato na posição 10 da cadeia b do hormônio, entre muitos outros exemplos. Um grande número de produtos de engenharia de proteínas já encontrou aplicações práticas em processos de fabricação.

A engenharia de proteínas é um ramo da biotecnologia que trata do desenvolvimento de proteínas úteis ou valiosas. Esta é uma disciplina relativamente nova que se concentra no estudo do enovelamento de proteínas e nos princípios de modificação e design de proteínas.

Existem duas estratégias principais para engenharia de proteínas: modificação dirigida de proteínas e evolução dirigida. Estes métodos não são mutuamente exclusivos; os pesquisadores costumam usar ambos. No futuro, um conhecimento mais detalhado da estrutura e função das proteínas, bem como avanços na alta tecnologia, pode expandir significativamente as possibilidades da engenharia de proteínas. Como resultado, mesmo aminoácidos não naturais podem ser incluídos graças a um novo método que permite a inclusão de novos aminoácidos no código genético.

A engenharia de proteínas originou-se na interseção da física e química das proteínas e da engenharia genética. Resolve o problema de criação de moléculas de proteínas modificadas ou híbridas com as características desejadas. Uma forma natural de implementar tal tarefa é prever a estrutura do gene que codifica a proteína modificada, a implementação de sua síntese, clonagem e expressão nas células receptoras.

A primeira modificação controlada de uma proteína foi realizada em meados da década de 1960 por Koshland e Bender. Para substituir o grupo hidroxila por um grupo sulfidrila no centro ativo da protease, a subtilisina, eles usaram o método de modificação química. No entanto, como se verificou, essa tiolsubtilisina não retém actividade de protease.

A proteína em termos químicos é uma molécula do mesmo tipo, que é uma cadeia ou polímero de poliaminoácidos. É composto por sequências de aminoácidos de 20 tipos. Tendo aprendido a estrutura das proteínas, as pessoas se perguntaram: é possível projetar sequências de aminoácidos completamente novas para que desempenhem as funções de que uma pessoa necessita muito melhor do que as proteínas comuns? O nome Protein Engineering surgiu para essa ideia.

Acima de tudo, o químico B. Merrifield conseguiu isso. Este americano conseguiu desenvolver um método extremamente eficiente para a síntese de cadeias de poliaminoácidos. Merrifield recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1984 por isso.

Figura 1. Esquema de funcionamento da engenharia de proteínas

O robô não conseguiu reproduzir exatamente as sequências de aminoácidos, ou seja, errou. Ele sintetizou uma cadeia com uma sequência e a outra com uma ligeiramente modificada. Numa célula, todas as moléculas de uma proteína são idealmente semelhantes entre si, ou seja, suas sequências são exatamente iguais.

Os cientistas tiveram que aprender com a natureza, procurando as modificações necessárias nas proteínas. A questão aqui é que mutações ocorrem constantemente na natureza, levando a uma mudança nas sequências de aminoácidos das proteínas. Se selecionarmos mutantes com as propriedades necessárias que processem este ou aquele substrato de forma mais eficiente, então é possível isolar desse mutante uma enzima alterada, devido à qual a célula adquire novas propriedades. Mas esse processo leva muito tempo.

Estratégias de engenharia de proteínas

Modificação de proteína direcionada. Na modificação direcionada de uma proteína, o cientista utiliza o conhecimento detalhado da estrutura e função da proteína para fazer as alterações desejadas. Geralmente, este método tem a vantagem de ser barato e tecnicamente descomplicado, uma vez que as técnicas de mutagénese dirigida estão bem desenvolvidas. No entanto, a sua principal desvantagem é que muitas vezes faltam informações sobre a estrutura detalhada de uma proteína e, mesmo quando a estrutura é conhecida, pode ser muito difícil prever o impacto de diferentes mutações.

Algoritmos de software de modificação de proteínas buscam identificar novas sequências de aminoácidos que requerem pouca energia para formar uma estrutura alvo predeterminada. Embora a sequência a ser encontrada seja grande, o requisito mais desafiador para a modificação da proteína é uma maneira rápida, porém precisa, de identificar e determinar a sequência ideal, em oposição a sequências subótimas semelhantes.

Evolução dirigida. Na evolução dirigida, a mutagênese aleatória é aplicada a uma proteína e a seleção é feita para selecionar variantes que possuam certas qualidades. Outras rodadas de mutação e seleção são aplicadas. Este método imita a evolução natural e geralmente dá excelentes resultados para modificação dirigida.

Uma técnica adicional, conhecida como embaralhamento de DNA, mistura e traz à tona partes de variantes bem-sucedidas para obter melhores resultados. Este processo imita as recombinações que ocorrem naturalmente durante a reprodução sexual. A vantagem da evolução dirigida é que ela não requer conhecimento prévio da estrutura da proteína, nem é necessária, para poder prever qual o impacto que uma determinada mutação terá. Na verdade, os resultados dos experimentos de evolução dirigida são surpreendentes, uma vez que as mudanças desejadas são frequentemente causadas por mutações que não deveriam ter tal efeito. A desvantagem é que este método requer um alto largura de banda, o que não é possível para todas as proteínas. Uma grande quantidade de DNA recombinante deve sofrer mutação e os produtos devem ser avaliados quanto à qualidade desejada. O grande número de opções muitas vezes exige a compra de robótica para automatizar o processo. Além disso, nem sempre é fácil rastrear todas as características de interesse.

Dicionário Eluição Eluição é um método de extração de uma substância (vírus) de um transportador sólido por lavagem Método de exibição O método de exibição é um método de apresentação de proteínas/peptídeos heterólogos na superfície de vírus, células ou culturas livres de células para selecionar proteínas ou peptídeos com as propriedades necessárias Biossensor Biossensor - sistema analítico (material biológico + conversor Eluição Eluição é um método de extração de uma substância (vírus) de um transportador sólido por lavagem Método de exibição O método de exibição é um método de apresentação de proteínas/peptídeos heterólogos na superfície de vírus, células ou propriedades livres de células Biosensor Biosensor é um sistema analítico (material biológico + transdutor) que permite detectar substâncias na amostra de teste e estimar suas concentrações

Engenharia de proteínas 4 Um conjunto de métodos e abordagens para estudar proteínas e obter proteínas com novas propriedades OBJETIVOS PRINCIPAIS Criar uma biblioteca de sequências de nucleotídeos e aminoácidos Investigar os efeitos de substituições de resíduos de aminoácidos únicos no enovelamento e função de proteínas Desenvolver métodos para modificação eficiente de proteínas dar-lhes as propriedades necessárias Desenvolver métodos e abordagens para triagem e seleção de proteínas com propriedades desejadas

Design racional Design racional A necessidade de conhecimento sobre a organização espacial da proteína A necessidade de conhecimento sobre interações intra e intermoleculares Imperfeição de métodos e direção de equipamentos que visam criar novas proteínas de novo pelo seu design espacial

Evolução dirigida de moléculas de proteínas uma direção que visa a criação de novas proteínas através da seleção 1 obtenção de bibliotecas de clones de sequências aleatórias de aminoácidos 2 seleção de cadeias polipeptídicas que tenham pelo menos um pequeno grau das propriedades desejadas 3 utilização de mutagênese aleatória obtenção de novas bibliotecas de clones de proteínas que são utilizadas na próxima rodada de seleção ou usando construções geneticamente modificadas que expressam novas proteínas

Evolução dirigida de moléculas de proteínas (variantes) redesenho racional usando mutagênese dirigida ao local para substituir resíduos de aminoácidos específicos no sítio ativo da engenharia enzimática de superfícies de proteínas por meio de mutações para alterar partes da cadeia polipeptídica nas proximidades de resíduos de aminoácidos que estão próximos uns dos outros na superfície do glóbulo de proteína, mas localizados a uma distância considerável um do outro na cadeia polipeptídica

Triagem e Seleção de Proteínas com Propriedades Alvo Triagem Aleatória Seleção de Triagem Melhorada Cada proteína é testada quanto às propriedades desejadas; a seleção de proteínas da biblioteca é aleatória; cada proteína é examinada quanto à presença das propriedades requeridas; a escolha de proteínas da biblioteca é possível aleatoriamente se os objetos que compõem a biblioteca diferem fenotipicamente (por exemplo, pela presença de atividade enzimática) são criadas condições para a preservação seletiva dos componentes da biblioteca que possuem certas propriedades (fago, célula display) são criadas condições para a preservação seletiva dos componentes da biblioteca, que possuem certas propriedades (fago, display celular) detecção de uma proteína com as propriedades necessárias entre um grande número macromoléculas que compõem a biblioteca de clones resultante

Apresentação de fagos Objetivo - expor proteínas estranhas na superfície do fago O método foi desenvolvido em 1985 para o bacteriófago filamentoso M13. (os genes pIII e pVIII são locais alvo adequados para inserção de um fragmento de cDNA estranho) O objetivo é expor proteínas estranhas na superfície do fago. O método foi desenvolvido em 1985 para o bacteriófago filamentoso M13. (os genes pIII e pVIII são locais alvo adequados para inserção de um fragmento de cDNA estranho) construir um gene híbrido que consiste nas sequências de codificação da proteína alvo e uma das proteínas de revestimento do fago com bacteriófago infecta E. coli durante a montagem do fago proteínas híbridas são incorporado na partícula do fago

Fagemídeo Fago auxiliar Genoma do fago Infecção de E. coli com biblioteca de plasmídeos de fago auxiliar/células de E. coli transformadas com fagemídeo são infectadas com fago auxiliar para produzir partículas de fago, em cuja superfície são expostas várias opções da proteína alvo, as células de E. coli transformadas com a biblioteca de plasmídeo/fagemídeo são infectadas com fago auxiliar para obter partículas de fago, em cuja superfície estão expostas várias variantes da proteína alvo

Perspectivas para a utilização prática da Medicina de Engenharia de Proteínas: *obtenção de novos fármacos; para a criação de ferramentas de diagnóstico e produção de vacinas; *estudar os mecanismos da resposta imune, bem como as doenças do sistema imunológico. Ecologia: *obter biocatalisadores na forma de células inteiras com enzimas imobilizadas em sua superfície; *para obter biossensores para fins de diagnóstico e monitoramento ambiente; *para a criação de bioadsorventes, a fim de remover substâncias tóxicas e íons de metais pesados do meio ambiente

Medição de glicose usando um eletrodo enzimático (representação esquemática do experimento de L. Clark). Oxidação da glicose pela enzima glicose oxidase na presença de oxigênio: glicose + O 2 H 2 O 2 + glucono-1,5-lactona. O H 2 O 2 é reduzido em um eletrodo de platina a um potencial de +700 mV; a corrente que flui no circuito é proporcional à concentração de peróxido de hidrogênio (isto é, indiretamente, glicose).

Dicionário Imobilização Imobilização é uma restrição da mobilidade das moléculas e seus rearranjos de confirmação Aerotank Aerotank é um sistema de tratamento de águas residuais, tanques nos quais WW, lodo microbiano e ar são misturados purificação de água, solo e atmosfera usando o potencial metabólico de objetos biológicos - plantas , fungos, insetos, vermes e outros organismos Imobilização A imobilização é a restrição da mobilidade das moléculas e sua confirmação de rearranjos e ar Tanque de metano O tanque de metano é um reservatório para o processamento biológico de poluentes orgânicos com a ajuda de bactérias em condições anaeróbicas Biorremediação Biorremediação é um conjunto de métodos para purificar a água, o solo e a atmosfera utilizando o potencial metabólico de objetos biológicos - plantas, fungos, insetos, vermes e outros organismos

Classificação das enzimas Classe Reações catalisadas Exemplos de enzimas Oxidoredutases Reações redutivas e oxidativas Mais de 200 enzimas são conhecidas. Catalase, glicose oxidase Transferases Transferência reversível de grupos de átomos de doadores para aceitadores. Mais de 450 enzimas são conhecidas. Piruvato quinase, proteína quinase Hidrolases Reações de hidrólise São conhecidas mais de 200 hidrolases. Protease, amilase, celulase Liases Clivagem não hidrolítica de grupos de átomos do substrato com formação de ligações duplas Mais de 100 liases são conhecidas. Aspartase, fumarase Isomerases Reações de rearranjo intramolecular de compostos orgânicos Mais de 50 enzimas são conhecidas. Glucoseimerase Ligases Reações de ligação de duas moléculas diferentes entre si São conhecidas mais de 100. DNA ligase, triptofano sintetase

Microrganismos Fontes de enzimas Os bacilos são biossintetizadores de ribonucleases, desoxirribonucleases e proteases, enquanto as leveduras são biossintetizadoras de glucoamilases, invertases e fosfatase ácida. Plantas amilase é isolada da cevada, fosfatase ácida da batata, peroxidase de rábano. Animais A lactato desidrogenase é isolada do coração do gado, a fosfatase alcalina é isolada do estômago. O estômago dos porcos é usado para obter pepsina.A lactato desidrogenase é isolada do coração do gado e a fosfatase alcalina é isolada do estômago. Estômago de porco é usado para produzir pepsina

Métodos de imobilização Métodos físicos Métodos químicos adsorção em carreador insolúvel, inclusão em poros de gel, separação espacial com membrana semipermeável e outros baseia-se na criação de novas ligações covalentes entre a enzima e o transportador

As vantagens das enzimas imobilizadas são separar as enzimas do meio reacional, interromper a reação no momento certo e obter um produto não contaminado com a enzima; realizar o processo de modo contínuo e controlar a taxa de reação; alterar as propriedades do catalisador, sua especificidade, dependência das condições de reação e sensibilidade aos efeitos desnaturantes; regular a atividade catalítica da enzima agindo no transportador

Enzimas na produção biotecnológica Fonte de enzimas, método de imobilização Biotecnologia Acetil neutralizado -9-fosfato sintase Enzima E. coli. Incorporação em gel de poliacrilamida. Síntese de ácidos siálicos. Peroxidase Uma enzima do rábano. Copolimerização e incorporação no gel de alginato. Oxidação de fenol em águas residuais. Células 3-cetosteróide desidrogenase de Mycobacterium globiformis. Incorporação em gel de poliacrilamida. Transformação de hidrocortisona em prednisolona

Lavryashina M.B. KemSU Métodos de biotecnologia ecológica Tratamento biológico de águas residuais Bio(fito)remediação Criação de inseticidas e herbicidas bioseguros Criação de inseticidas e herbicidas bioseguros Obtenção de energia limpa Criação de plantas agrícolas resistentes a doenças Lixiviação bacteriana de metais Clonagem de espécies animais ameaçadas e extintas

Métodos de tratamento de águas residuais O problema mais importante biotecnologia - tratamento de águas residuais

Os aerotanques operam em combinação com um equalizador, tanques de decantação, um regenerador de lodo e um compactador de lodo (prensa). aerotanque aerotanque

Tanque de metano Tanque de metano (de metano e tanque inglês - tanque, cisterna) Grupos de bactérias Substâncias iniciais Produtos HIDROLÍTICO ACETOGÊNICO Poluentes orgânicos Ácidos graxos superiores PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO Ácidos graxos superiores H 2, CO 2, CH 3 COOH PRODUÇÃO DE METANO H 2, CO 2, CH 3 COOH CH 4, CO 2

Fases da fermentação do metano 1 biohidrólise do polímero e acidogênese (substâncias orgânicas são convertidas em ácidos graxos superiores, acetato e hidrogênio) 2 acetogênese e desidrogenação (acetato e hidrogênio são formados a partir de ácidos graxos superiores) 3 Metanogênese (metano, hidrogênio e hidrogênio são formados a partir do acetato dióxido de carbono)

Eu fase. DESENVOLVIMENTO DE CELULOSE (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) PROTEOLÍTICA PROTEOLÍTICA (Clostridium, Petrococcus) Fase II. ACETOGÊNICO (Syntrophobacter wolinii) fase III. GERADORES DE METANO (Metanobacterium thermoautotrophyum, Methanococcus vannielii) Exemplos de microrganismos

BIOREMEDIAÇÃO O método baseia-se na capacidade dos microrganismos utilizarem substâncias orgânicas complexas e decompô-las em substâncias simples “biologicamente seguras” Biologia molecular e genética Ecologia Ciências da engenharia Microbiologia BIOREMEDIAÇÃO

Biorremediação. Abordagens. Utilizando a atividade de microrganismos "selvagens" naturais Utilizando a atividade de microrganismos "selvagens" naturais (é necessário um intensificador, por exemplo, O 2) Utilizando cepas ativas introduzidas na forma de produtos biológicos em locais de intensa poluição

Estudo da biodiversidade de áreas contaminadas Isolamento de microflora capaz de destruir poluentes removidos Ativação de microflora local (bioestimulação). Introdução de microrganismos destruidores especiais em áreas contaminadas (biorremediação) Biorremediação. Estágios.

POLUIÇÃO Análises químicas Tecnologias de engenharia Bioestimulação (Comunidades microbianas naturais)Bioestimulação Biorremediação (Produtos biológicos microbianos artificiais)Biorremediação Monitoramento da biorremediação Biofitorremediação (Comunidades de plantas e microrganismos) Biofitorremediação

Construção de plantas transgênicas resistentes a insetos-praga 1. SÍNTESE DE TOXINAS ESPECÍFICAS 2. SÍNTESE DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS QUE AFETAM AS PAREDES CELULARES DE LARVOIAS DE INSETOS E OUTRAS PRAGAS E PATOGÊNIOS /QUITINASE, -1,3- GLUCONASE, PR-PROTEÍNAS / 3. SIN ESTES Inibidores e inibidores da proteinase das enzimas de polissacarídeos vegetais 4. Modificação do metabolismo secundário da planta para: a) Limitação das substâncias necessárias b) Síntese de novos repelentes e toxinas 5. Regulação da resposta protetora: a) Expressão do gene digital tecissues B) regulação da expressão gênica POR VÁRIOS FATORES NATURAIS E ARTIFICIAIS Aumento da resistência das plantas transgênicas ao patógeno fúngico Phomopsis helianhi Aumento da resistência das plantas transgênicas ao patógeno fúngico Phomopsis helianhi A B A - planta não transgênica B - planta transgênica A - planta não transgênica B - planta transgênica

Lista aproximada de tópicos incluídos na prova de crédito 1. História da biotecnologia. Características dos períodos históricos. As descobertas mais significativas que desempenharam um papel importante no desenvolvimento da ciência. 2. Conceitos gerais biotecnologias: sistema biotecnológico, processo biotecnológico, objeto biotecnológico. 3. Objetos biotecnológicos, definição, características do lugar de um bioobjeto em um sistema biotecnológico, classificação, exemplos aplicação prática. 4. Microrganismos como objetos biológicos. Exemplos, uso prático em biotecnologia. 5. Culturas de células e tecidos como objectos biológicos. Exemplos, uso prático em biotecnologia. 6. Processo biotecnológico. Estágios. Breve descrição das etapas do processo biotecnológico. 7. Características dos microrganismos como objetos de seleção. Seleção de microrganismos em biotecnologia. 8. Mutagénese: definição, formas de mutagénese, factores mutagénicos. 9. Seleção de microrganismos mutantes criados no processo de seleção na fase preparatória do processo biotecnológico. 10. Seleção de objetos biológicos. Etapas, abordagens, métodos.

11. Engenharia genética: finalidade, técnica, objetos biológicos, exemplos de aplicação prática, conquistas modernas. 12. Enzimas de engenharia genética. Classificação, características das reações catalisadas. 13. Métodos de obtenção de um gene em engenharia genética. Breve descrição, vantagens e desvantagens dos métodos. 14. Vetores em engenharia genética. Definição, classificações, requisitos, uma breve descrição de vetores. 15. DNA recombinante. Definição, finalidade, métodos de obtenção de DNA recombinante em engenharia genética. 16. Métodos para introdução de DNA recombinante em uma célula receptora e seleção de células modificadas em engenharia genética. 17. Transgênese vegetal. Vetor. Estratégias básicas. Métodos de introdução de transgenes e seleção de organismos transgênicos. 18. Transgênese animal. Vetor. Estratégias básicas. Métodos de introdução de transgenes e seleção de organismos transgênicos. 19. Engenharia celular: finalidade, técnica, objetos biológicos, exemplos de aplicação prática, conquistas modernas. 20. Métodos de cultura de células e tecidos vegetais. Condições de cultivo, classificação e breves características das culturas vegetais em engenharia celular

21. Híbridos somáticos de plantas. Técnica de produção, conquistas modernas, exemplos de aplicação prática. 22. Protoplastos: definição, utilização em engenharia celular, métodos e condições de isolamento de protoplastos. 23. Cultivo e fusão de protoplastos em engenharia celular. Métodos, condições, fusogênios. 24. Utilização prática de culturas celulares e tecidos vegetais. Biossíntese e biotransformação, micropropagação, exemplos de plantas transgênicas com propriedades valiosas. 25. Engenharia de células animais. Métodos, objetos, técnica, conquistas modernas, aplicação prática. 26. Culturas de células e tecidos de animais. Classificações de culturas, condições de cultivo, meios, métodos de obtenção de híbridos somáticos, aplicação prática. 27. Células-tronco. Característica. Classificação. Perspectivas de aplicação. 28. Clonagem. Característica do método. Classificação. Perspectivas de aplicação. 29. Processo biotecnológico. Estágio de cultivo. Principais etapas, caracterização de meios para microrganismos, células vegetais e animais. Equipamento. 30. Processo biotecnológico. Estágio de cultivo. Modos de cultivo de objetos biológicos. Etapas de crescimento da cultura em biorreator, síntese do produto alvo.

31. Processo biotecnológico. A etapa de obtenção do produto. As principais etapas e métodos de separação e purificação de um produto biotecnológico. Exemplos de produtos biotecnológicos. 32. Biotecnologia ecológica: finalidade, métodos, objetos biológicos, exemplos de aplicação prática, conquistas modernas. 33. Biotecnologia ecológica. Problema água potável. Métodos aeróbicos de tratamento de águas residuais. 34. Biotecnologia ecológica. O problema da água potável. Métodos anaeróbicos de tratamento de águas residuais. 35. Biotecnologia ecológica. Biorremediação, biofitorremediação. 36. Biotecnologia: finalidade, assunto, tarefas, principais direções da biotecnologia. Conquistas modernas no campo da biotecnologia. 37. Enzimologia de engenharia. Objetivo, problemas. Perspectivas. Fontes de enzimas. 38. Enzimas imobilizadas. Vantagens, métodos de imobilização. 39. Enzimas imobilizadas. Portadores para imobilização, uso prático. 40. Engenharia de proteínas. Direções, métodos, perspectivas.